酸化剂主要包括单一酸化剂和复合酸化剂，单一酸化剂分为有机酸和无机酸。目前使用的无机酸化剂主要包括盐酸、硫酸和磷酸，其中以磷酸居多。有机酸化剂主要有柠檬酸、延胡索酸、乳酸、丙酸、苹果酸、山梨酸、甲酸、乙酸等。复合酸化剂是将2种或2种以上的单一酸化剂按照一定的比例复合而成，可以是几种酸配合在一起使用，也可以是酸和盐类复配而成，通过与饲料或水结合，动物食用后，能改善其消化道环境以满足营养需要及疾病预防的需要[1]。下面将详细说明饲料酸化剂中磷酸，柠檬酸，乳酸，富马酸以及总酸含量的检测方法。

1．磷酸的检测

1.1磷酸的鉴别

磷酸是一种常见的无机酸，是中强酸，酸性强,在使用过程中极容易离解的特点；判断饲料酸化剂中是否有磷酸可以用以下方法：

1.1.1试剂

氢氧化钠溶液：4 0g/L  硝酸银溶液，1 0 g/L 酚酞指示液：1 0 g/L

1.1.2 鉴别方法

称取约1g试样，置于100ml烧杯中，加10ml水，1滴酚酞指示液，用氢氧化钠溶液调至中性，滴加硝酸银溶液，有黄色沉淀生成，该沉淀能溶于稀硝酸( 5 0 0 ) 或氨水。

1.2磷酸定量检测方法—容量法

1.2.1 方法提要

根据磷酸性质，以百里酚酞为指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液直接滴定，以确定磷酸含量。

1.2.2试剂

氢氧化钠标准滴定溶液：约1mol/L；

百里酚酞指示液：1g/L

1.2.3 分析步骤

称取约1.5克试样，精确至0.0002克，移人250mL锥形瓶中， 加120mL水和5 滴百里酚酞指示液， 用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至浅蓝色即为终点。

1.2.4 结果计算

磷酸( H3P O4) 含量的质量分数 W1 ， 数值以%表示， 按式( 2 ) 计算:

式中：

V — 滴定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升 ( mL )；

c — 氢氧化钠标准滴定溶液浓度的准确数值，单位为摩尔每升( mo l / L )；

m— 试样的质量的数值，单位为克；

M— 磷酸 (H3P O4) 的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔 ( g / m o l )  ( M = 4 9 ) .

取平行测定结果的算术平均值为测定结果; 平行测定结果的绝对差值不大于0.2%。

2．饲料酸化剂中总酸含量的测定：酸碱滴定法

2.1 方法摘要

根据酸碱中和原理，用碱液滴定试液中的酸，以酚酞为指示剂确定滴定终点。按照碱液的消耗量计算饲料中的总酸含量。

2.2 试剂与溶液：0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液；1%酚酞溶液

2.3 分析步骤

精确称取0.5克左右的饲料酸化剂样品，置于250mL三角瓶中，加入50mL水及1%酚酞溶液2滴，氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色30S不褪色，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值（V1）。同一被测样品应测定两次。

空白试验：用水代替试液，按照上面步骤操作，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值（V2）。

2.4 结果计算

饲料酸化剂中总酸含量以质量分数X计，数值以克每千克（g/Kg）表示,按式(1)进行计算：

式中：

C— 氢氧化钠标准滴定溶液浓度的准确数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

V1—滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）;

V2—空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）;

K—酸的换算系数：苹果酸：0.067；乙酸：0.06；柠檬酸：0.064；柠檬酸：0.07（含一分子结晶水）；乳酸：0.09；盐酸：0.036；磷酸：0.049；

M—试样质量的数值，单位为克（g）.

计算结果表示到小数点后两位。

2.5 允许差

同一样品两次测定结果之差，不得超过两次平均测定值的2%。

3 乳酸，柠檬酸的同时测定

3.1仪器：Agilent 1200型高效液相色谱，带紫外检测器

3.2试剂：乳酸 柠檬酸标准品  磷酸二氢钾-磷酸缓冲溶液（0.1N，PH约为3）蒸馏水

3.3 色谱条件

色谱柱：XDB--C18 4.6×150mm 5um；柱温：30℃；进样量：10ul;流速1ml/min;检测波长：215nm;流动相：0.1mol/L磷酸二氢钾，磷酸调PH到3

3.4 样品前处理：称取适量样品0.3—1.0克，加入100ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，0.45um滤膜过滤，上HPLC测定。

3.5乳酸、柠檬酸的测定

分别注射等体积20 µL的乳酸，柠檬酸标准溶液和样品溶液进色谱，记录色谱图（乳酸，柠檬酸的保留时间大约是5min以内）。记录每张图上乳酸，柠檬酸的峰面积响应。

3.6 乳酸、柠檬酸含量的结果计算

乳酸，柠檬酸含量按式（2）计算：

式中：

X2——乳酸或者柠檬酸的含量，单位为克每百克（%）；

AU——乳酸或者柠檬酸在样品中的面积响应；

CS——乳酸或者柠檬酸标准样品的质量，单位为毫克（mg）；

AS——乳酸或者柠檬酸在标准品中的面积响应；

WU——乳酸或者柠檬酸样品的质量，单位为毫克（mg）

3.7 方法定量检出限

本标准的方法定量检出限为：0.2mg/Kg

3.8 允许差

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

4.富马酸的测定

富马酸（Fumaric acid）又称反丁烯二酸，紫堇酸、地衣酸，延胡索酸。通常为白色结晶粉末，有水果酸味。化学式是C4H4O4。为最简单的不饱和二元羧酸。用于生产不饱和聚酯树脂。

4.1原理

试样经缓冲液提取，固相萃取柱净化后，用高效液相色谱法检测，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

4.2感官性状：白色结晶颗粒或粉末，微溶于冷水，易溶于热水。

4.3试剂和材料：磷酸：色谱纯；蒸馏水；0.5%磷酸溶液:称取0.495ml磷酸，加水至100ml溶解，经0.45um滤膜过滤；蒸馏水：0.5%磷酸=9：1

4.4仪器和设备：高效液相色谱仪：配备紫外检测器。

4.5色谱条件：色谱柱：色谱柱填充十八烷基硅胶，柱250×4.6 mm：流动相：蒸馏水：0.5%磷酸=9：1；流动相流速: 1 mL/min；检测波长：205nm；进样量：20 μL；柱温：30℃。

注：系统适用性为三次重复注入标准溶液所得到的面积响应的相对标准误差不大于2.0％。

4.6分析步骤

4.6.1 样品溶液的制备

准确称取50 mg的富马酸样品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀（含量>20%时）。

4.6.2 标准溶液的制备

准确称取50mg富马酸标准样品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀。

注：因富马酸微溶于冷水，易溶于热水，蒸馏水应加热。

4.6.3 富马酸的测定

分别注射等体积20 µL的富马酸标准溶液和样品溶液进色谱，记录色谱图（富马酸的保留时间大约是3min）。记录每张图上富马酸的峰面积响应。

4.7 富马酸含量的结果计算

富马酸含量按式（2）计算：

式中：

X2——富马酸的含量，单位为克每百克（%）；

AU——富马酸在样品中的面积响应；

CS——富马酸标准样品的质量，单位为毫克（mg）；

AS——富马酸在标准品中的面积响应；

WU——富马酸样品的质量，单位为毫克（mg）。

4.8 方法定量检出限

本标准的方法定量检出限为：0.2mg/Kg

4.9 允许差

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

5．分析与讨论

5.1 摸索检测有机酸的实验条件。实验中发现采用C18柱分离有机酸时，乳酸和乙酸的保留时间基本上一致，无法分离，如下图所示：

采用Grom-Sil 能较好的分离乙酸和乳酸[2]。冯向东等文章中[3]采用硫酸酮作为流动相，乳酸和乙酸的分离结果还是不理想，如下图：

5.2 柠檬酸，乳酸和富马酸可以同时测定，但是由于富马酸微溶于冷水，易溶于热水的特性，样品前处理方法不一致，且有些饲料酸化剂含富马酸较多，峰形太大；建议单独检测富马酸，结果更准确可靠。

5.3除上面的检测方法以外,还可以对酸化剂酸化特性进行体外评定:

（1）pH 值评定：将酸化剂配成1%水溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，用 pH 计测定其 pH 值，以 60 秒内 pH 计读数不变记为溶液的 pH 值，每个酸化剂样品测 3 个平行，取其平均值。

（2）缓释能力评定：酸化剂产品缓冲能力定义：单位时间 pH 值变化量，pH/h。 称取酸化剂样品 1.0g，用 99.0g 去离子水配成 1%水溶液，将其置于 37℃水浴锅中，保持恒温。每隔 1 小时用 pH 计测其 pH 值一次，以 pH 计读数在 60 秒内不变记为溶液pH 值，按照仔猪吃一次日粮的时间间隔，一般食物在仔猪消化道内停留约 6 小时左右，所以共测定 7 次溶液 pH 值，每个样品测 3 个平行，取其平均值，做出变化曲线，从而反映酸化剂的缓释情况。

（3）缓冲能力评定：称取 1.0g 酸化剂样品，用 99.0g 去离子水配成 1%水溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，加热并保持在 37℃，将 pH 计电极探头插入溶液中，然后向溶液中滴加 1mol/L 的 NaOH溶液，直到 1%酸化剂水溶液 pH 值改变一个单位，记录 NaOH 溶液的消耗量，即为酸化剂 1%水溶液缓冲量。每个样测 3 个平行，取平均值。

（4）对日粮系酸力的影响能力评定：首先测定日粮的基础系酸力，测定方法：用烧杯称取100g常规仔猪日粮风干样，加入 200ml 去离子水，用磁力搅拌器搅拌均匀，呈浆状液，接着用 1mol/L 的盐酸溶液滴定至 pH 值为 4.0，记录所消耗盐酸的毫升数。然后用同上的方法测定加酸化剂后日粮的系酸力。

日粮系酸力改变量＝日粮基础系酸力－加酸后日粮系酸力。